單層培養(yǎng)傳代步驟

 

單層培養(yǎng)的細胞系在進行原代培養(yǎng)時，隨著培養(yǎng)時間的延長和細胞的不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面由于營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡、代謝廢棄物不斷積累，導(dǎo)致細胞停止生長甚至死亡。此時，為獲得大量的、穩(wěn)定的同種細胞，并保證細胞始終維持快速生長，可以將單層細胞從培養(yǎng)基質(zhì)上分離下來制成單細胞懸液，按照推薦濃度接種到若干個新的培養(yǎng)器皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，這個過程就稱為傳代（Passage）或再培養(yǎng)（Subculture）。

 

單層細胞傳代培養(yǎng)，需要將細胞間及細胞與培養(yǎng)基質(zhì)之間的連接打斷。對于某一些松散貼壁的細胞類型，只需輕敲培養(yǎng)器皿側(cè)面，細胞就會脫離下來。絕大多數(shù)貼壁細胞需要使用蛋白水解酶例如，trypsin/EDTA消化破壞上述連接。還有少數(shù)細胞需要使用機械力，例如使用細胞刮，使細胞分離下來。對單層培養(yǎng)而言，細胞生長接近指數(shù)生長期末時（大約70%-90%匯合），即可進行傳代。一般生長穩(wěn)定的細胞4~7天傳代一次。

 

單層培養(yǎng)傳代步驟：

 

1. 事先將培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA溶液、Trypsin中和液、DPBS在室溫平衡，并準(zhǔn)備若干已包被好poly-L-lysine或Fibronectin等的培養(yǎng)器皿。

 

注：不推薦使用37℃水浴鍋對上述溶液進行平衡。

 

2. 將長滿細胞的培養(yǎng)器皿中原有培養(yǎng)液吸棄，DPBS洗滌細胞1-2次。

 

3. 加入適量（略蓋過細胞即可）Trypsin-EDTA溶液室溫孵育0.5-2 min，不定時在顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，直至約80%細胞收縮、變圓突起（round up），立即加入等體積Trypsin中和液終止消化。

 

注：不同類型細胞消化時間長短不一，佳消化時間需自行摸索。

 

4. 輕輕晃動培養(yǎng)容器使細胞脫離，并將消化下來的細胞收集、轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)。另取適量*培養(yǎng)基潤洗培養(yǎng)容器，將殘留的細胞一并轉(zhuǎn)移至離心管。

 

注：細胞收集完畢后，可以在顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器內(nèi)還有多少細胞殘留（通常應(yīng)少于5%），以此判斷細胞收獲是否*。 

 

5. 將收獲的細胞懸液于1000rpm下離心5min，棄上清，然后用適量*培養(yǎng)基重懸細胞。

 

6. 計數(shù)細胞，然后根據(jù)推薦的接種密度重新接種到新的已包被好的培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)器皿置于37℃, 5% CO2/95% air培養(yǎng)箱培養(yǎng)，視細胞生長情況，每隔2-3天換一次液，詳見datasheet。

 

注：有限細胞系的增殖速率較低，其原代培養(yǎng)通常以1:1，1:2或1:3的比例進行傳代，但是對于增殖速率很高的連續(xù)細胞系（或無限細胞系），通常要以更高的比例進行傳代。